共焦和数字光片成像

如果可以只记录焦点中的特征并测量相对z-位置，我们就可以解决焦点深度问题:在记录一堆图像之后，我们可以重建整个样本，去掉模糊部分，并在所有三个维度上量化对象。

最常见的是共聚焦显微镜[1]当提到光学切片时，请记住。共聚焦原理被无缝地集成到标准类型的光学显微镜中(尽管技术集成需要相当多的修改)。与普通光学显微镜不同，真正的共聚焦成像要求对单个点的照明尽可能小。光斑的直径由波光学控制，在d≈λ/NA处达到衍射限制的最小值。详细的强度分布用点扩散函数描述。与此同时，探测器还必须感应到一个尽可能小的点。由于光路是对称的，同样的数学也适用于点状探测器的传感分布。点探测器是通过在探测路径的中间像面上引入针孔孔径来实现的。在样品中，照明和检测的焦点必须重合-因此“共聚焦”显微镜。如图1所示，这个针孔的效果是光学去除所有不是来自焦平面的射线。 Its function is that of a spatial filter in z-direction.

由于光学刀一次只在一个点上工作，为了生成图像，这个点必须从上到下依次移动。强度被同步转换为数字信息并存储在计算机的一个框架存储器中。从这个电子存储器中，图像显示在普通显示器上。由于图像必须按顺序逐点构建，因此只有在影响帧格式和可接受的信噪比的某些限制下才可能实现高帧速率。高度透明的光束路径，例如徕卡SP检测器和非常高效的传感器，如混合探测器(HyDs)有助于提高高帧速率性能。与此同时，在共聚焦显微镜中实现了高达12,000 Hz的线频率，而pal标准电视中的线频率约为15,000 Hz。在适当的条件下，帧率可达每秒约500帧。然而，为了获得足够高的信噪比图像，帧率通常不会超过每秒10帧。

与扫描过程相关的另一个问题是，样品在焦平面上方和下方的区域暴露在大量的照明能量下，这对图像没有贡献，但可能导致荧光色素的光物理降解。由于荧光色素也吸收焦平面以上的光，当聚焦到样品深处时，荧光强度越来越暗。这可以通过自动增益适应来补偿，但以信噪比为代价。

真正的共聚焦成像的积极方面是高分辨率(高na透镜很容易应用)，事实是，图像在焦平面上本质上是均匀的，标准的准备是容易和不费力地用共聚焦显微镜分析。共聚焦显微镜是基于标准的同轴光学显微镜，所有标准的显微镜方法和对比模式都可以通过一个简单的开关进入显微镜。它也是其他类型扫描显微镜的基础，如多光子激发，高谐波产生显微镜，相干反斯托克斯拉曼散射显微镜和超分辨率技术发生的(激发发射耗竭显微镜)。

虽然共聚焦显微镜是光学切片的金标准，但在半个世纪前，第一个完成这项任务的显微镜就已经问世了。“Spalt-Ultramikroskop”[２]使用一个明亮的光源(弧光灯或太阳)，它被聚焦到一个狭缝孔径。第二个透镜，通常是一个重复使用的物镜，将这个狭缝投射到标本中，与显微镜的光轴垂直。这种设计有效地创造了大约两微米厚度的片状照明。最初的应用涉及亚分辨率粒子，就像彩色玻璃中分散的黄金。然后，它被证明是有用的各种胶体样品和混浊介质，这是化学和医学研究中常用的分析。188bet怎么注册这种早期的光片显微镜被限制在可见5纳米以下的微小颗粒，这导致照明的球形散射，在显微镜的垂直光束路径中可以观察到衍射图案。因此，它可视化了不可分解的粒子，称为“Ultramikronen”，它“超出了显微镜的分辨率”。“超显微镜”这个名字首先会让人联想到一种超分辨率类型的设计，但作者清楚地表明，超显微镜明显受到光学衍射的限制。

图2:Spalt-Ultramikroskop的光路示意图。激发光被物镜1通过狭缝(Spalt)正交聚焦到样品中。发射物由物镜2收集，并可由相机记录为光学部分。

后来，发明了绕过精密狭缝的设计，使用桶形透镜来制造垂直于光轴的光片[3]．这种安排然后用于荧光固定样品。光片显微镜被证明特别有利于厚样品的快速实时成像，因为漂白不太明显，图像记录由数码相机并行执行共焦和数字光片成像如惠斯肯所示[6]．在z方向上的吸收不是一个问题，因为在显微镜聚焦的z中所有位置的照度都是相等的。但是，像普通显微镜一样，发射光必须通过样品，这在厚样品中可能会在一定程度上影响图像。尽管如此，在横向上仍然存在阴影效应:光首先在照明光进入样品的一侧被吸收，因此荧光在相反的一侧变暗。Voie[3]通过旋转样本和从不同方向收集图像来补偿这种效果。Dodt[7]从两个相对的侧面照射样品以补偿光片的吸收。凯勒没有使用投影的狭缝光圈或圆柱形透镜[4]扫描一束垂直于观测轴的细激光束。该方案被称为“数字扫描光片”。

这两种范式已被引入生物医学研究和日常工作中，为生物学概念和疾病以及细胞成分的结构和功188bet怎么注册能提供了许多新的见解和理解。在仪器方面，两种方式有明显的不同，正交照明被视为系统的一个单独的部分，并与同轴显微镜相结合来执行任务。共聚焦显微镜使用光束扫描系统来创建二维图像，数字扫描的光片使用光束扫描来创建从线开始的区域。这立即提出了一个问题，即是否有可能在一个系统中结合两种策略。188金宝搏的网址徕卡微系统公司在新款徕卡上引入了这种组合TCSSP8DLS薄片显微镜［5］．

徕卡TCSSP8DLS是基于普通共聚焦显微镜的同轴扫描装置，它通过检测针孔对离焦光进行空间滤波来进行光学切片。图像是通过在两个横向方向上移动照明点的电振扫描镜产生的。要将这种系统转换成数字光片显微镜，必须使光照光束垂直于光轴穿过样品。通过在焦平面的位置引入一个小镜子，就在观测场的外面，实现了所需的正交照明。这样的偏转镜机械地连接到观察透镜上，以确保被照亮的z轴位置始终在图像生成光学器件的焦点上，同时图像被投射到摄像机上，摄像机将强度转换为数字图像。

光照光束的单一位置不会产生二维图像，而只会产生单线。人们可以利用在共聚焦显微镜中固有的横向扫描模式之一在垂直方向上扫描照明线，产生所需的二维平面。

如果在相反的一侧引入第二个镜子，就可以通过相同的透镜从两侧照亮样品-只需使用共聚焦显微镜的光束扫描装置的第二个轴。这满足了补偿吸收引起的阴影的需要。最后的图像再一次由两张不同照明方向的图像构建。

对于共焦模式成像，z-驱动机构必须定位，以使照明光束的焦点与要成像的特征重合。扫描过程只覆盖视野的内部，这是操作共聚焦显微镜的常用方法。为了切换到光片采集，焦点必须移动大约镜面到光轴的距离。在这种情况下，照明光束的平面生成部分将落在观测场的中心。扫描设备需要指向视场的边缘才能击中镜子。

这种组合不仅降低了仪器成本，因为两个不同的仪器合并为一个，但它也允许经典共聚焦和数字光片显微镜的组合。因此，同样的系统允许用最适合解决当前研究问题的技术来探索任何样本。它还提供了各种新的应用机会，因为共聚焦路径可以用于随后的诱导效应的温和光片成像的光操作。

1. 显微设备。美国专利3.013.467，提交7^th1957年11月，授予19^th1961年12月(1961)。
2. Siedentopf H, Zsigmondy R: Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikroskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser。安。理论物理。Iv(10): 1-39(1903)。
3. Voie AH, Burns DH，和Spelman FA:正交平面荧光光学切片:宏观生物标本的三维成像。中华显微杂志170(3):220-36(1993)。
4. Keller PJ等人:用扫描光片显微镜重建斑马鱼早期胚胎发育。科学322:1065(2008)。
5. Knebel W和Sieckmann F: Verfahren und Anordnung zur Beleuchtung einer Probe。德国专利申请，出版物no . DE 10 2011 054 914 A1(2011)。
6. Huisken J等:用选择性平面照明显微镜对活胚胎深部进行光学切片。科学通报，30(4):344 - 344(2004)。
7. Dodt HU等人:超微显微镜:整个小鼠大脑神经元网络的三维可视化。方法4(4):331-36(2007)。