穿透深度是由入射角和波长的激光
隐失波的穿透深度范围被定义为初始强度的37%在隐失波下降的接口仍然是可用的。这主要取决于激光的入射角遇到玻璃/水或玻璃标本接口(阅读更多关于TIRF显微镜的原则)。因此,控制入射角是必不可少的控制隐失波的穿透深度。严格、准确、可靠和可再生的控制激光的入射角也强制要求确保实现结果的再现性。激光的入射角反过来取决于激光点的径向距离backfocal飞机的目标,这是确定的TIRF扫描仪。
隐失波的穿透深度范围被定义为初始强度的37%在隐失波下降的接口仍然是可用的。这主要取决于激光的入射角遇到玻璃/水或玻璃标本接口(阅读更多关于TIRF显微镜的原则)。因此,控制入射角是必不可少的控制隐失波的穿透深度。严格、准确、可靠和可再生的控制激光的入射角也强制要求确保实现结果的再现性。激光的入射角反过来取决于激光点的径向距离backfocal飞机的目标,这是确定的TIRF扫描仪。
另一个因素决定的穿透深度隐失场激发所需的激光的波长。这可以成为一个问题TIRF实验采用多个荧光团的地方。在此类实验中切换不同的激光线会导致不同的隐失波的穿透深度。从这些实验结果的解释必须非常仔细地进行,试样的体积渗透的隐失波,因此荧光团的数量随激发波长是兴奋。实现可靠的、可量化的结果是强制性的隐失波的穿透深度保持在一个恒定值。这只有通过不同渗透深度的隐失波产生的激光线补偿通过改变入射角的选择相应的激光线。
完全控制的穿透深度与徕卡TIRF阵列
确保可再生的和可靠的穿透深度的隐失波激发波长改变,即使在徕卡微系统采用特殊的硬件完全自动化TIRF调整过程。徕卡的主要部分TIRF模块是一个TIRF准直器和扫描仪TIRF传感器。的TIRF扫描仪控制激光束的位置放置backfocal飞机的目标。因此,它控制激光的入射角标本。准直激光束集中在后方目标平面(backfocal平面)实现均匀照明领域的观点。的TIRF玻璃反射的光传感器检测标本或玻璃/水界面全内反射的情况。
这使得TIRF传感器系统的一个特殊部分,因为它允许发生全内反射被检测出来。实验者因此可以100%确保获得的图像是真实的TIRF图像。完全自动的调整过程,TIRF扫描仪将激光束通过客观和backfocal飞机TIRF传感器检测到一个范围的扫描位置发生全内反射。这些信息然后系统计算,考虑到激光的波长,由此产生的隐失波的穿透深度所有可能的扫描仪的位置。
对齐后可以切换激光线,同时保持一个常数隐失波的穿透深度,扫描仪将自动改变激光束backfocal平面上的位置的目标。这就确保了激光总是期望的入射角产生隐失场的要求穿透深度对激光的波长。都是自由确定的结果,但是稳定和完全可再生的隐失波的穿透深度所有可用的波长。
图3:TIRF图片的荧光标签Rab11(绿色)和Gal3(红色)蛋白质MDCK细胞的顶端膜的囊泡。图片是用不同的穿透深度设置。左上:90海里,右上:110 nm,左中心:150海里,中心:200海里,左下:250海里,和右下角:Epi模式。注意到越来越多的可见囊泡和信噪比的降低。图像获取与徕卡TIRFMC系统。苏菲Veitinger博士的研究所细胞生物学和细胞病理学,菲利普斯马尔堡大学,德国。
灵活TIRF扫描仪使小矿脉成像和方位的选择
雇佣一个高度灵活的TIRF扫描仪有额外的好处。如前所述,该系统完全承认在激光位置(或扫描仪的位置)发生全内反射,反之亦然,这并非如此。哪里的知识全内反射时,不可以用来阐明样品在一个特殊的所谓小矿脉模式。如果激光遇到玻璃/水界面一个角低于所需的临界角全内反射,激光束通过标本间接。因此,只有部分的标本被激光光束,只有遇到本卷中荧光团是兴奋。这将导致较低的图像背景和一个非常好的信噪比与传统的数字化图像。该方法的一个额外的好处是,漂白,光毒性大大降低,从而延长细胞生存能力,特别是在长期的实验。小矿脉模式尤其适用于定量研究的动态运动,分子和单分子的分布或交互跟踪。泡一个标准的应用程序跟踪。
的另一个优势TIRF扫描仪与自由耦合位置可确定的是,(所谓的方位)方向的激光遇到玻璃/水界面可以选择。这意味着隐失波的波前的方向可以选择。这反过来影响隐失波的传播方向(水平或垂直的玻璃/水界面)。传播方向反过来会影响荧光团激励的效率,因为他们通常有一定取向的偶极子。在徕卡TIRF系统可以选择四个方位之间的位置,以确保最佳的激发的荧光团。
一个声光可调谐滤波器(AOTF)和多模激光纤维保证超速波长切换和同质的照亮TIRF字段
徕卡的好处TIRF可靠性是多色的最明显TIRF显微镜在延时的应用程序中。为此,快速切换不同的激光线是强制性的。这是通过使用一个AOTF选择所需的激光线而不是过滤系统。AOTFs能够切换波长在微秒vibration-less方式和降低传输损耗相比,基于过滤器系统。一个AOTF还允许调整激光束的强度经过。此外,如果AOTF使用百叶窗会过时,也加速了激光线间切换。
另一个因素为最好的TIRF显微镜是一个同质的照明领域的观点。对激光TIRF显微镜这是强烈依赖于特定的激光光纤系统中使用。最好的同质性可以通过使用多模光纤激光器具有极高数值孔径的徕卡使用TIRF系统。
