如何准备你的标本免疫荧光显微镜吗

根据实验的类型有两种不同的免疫荧光(如果)变异:在直接或主要免疫荧光(如果)一个特定主要抗体与荧光染料用于绑定到目标结构及其直接可视化。

在第二个变种,称为间接或二级免疫荧光,一个两步进行孵化。首先,一个特定的主要抗体识别目标结构。然后fluorochrome-coupled二级抗体应用,特别是结合主要的抗体。这种特异性得到指导二级抗体的物种主要抗体(见长大抗体和荧光染料)。比较两个免疫荧光变体,他们每个人都有不同的优点和缺点:

通过耦合主要抗体与荧光染料,直接免疫荧光(如果)比间接更快版本耗时的洗涤和孵化步骤省略。因此,直接免疫荧光(如果)更容易处理,因此适合样品的快速分析标准化的免疫荧光(如果)的实验,例如在临床实践中。然而,有必要采用一个运转良好的主要与高亲和力抗体抗原。同时这是一个消极的方面,如fluorescence-coupled和验证主要抗体是昂贵的。此外,您需要一个单独的初级抗体为每个目标结构,和链接直接免疫荧光抗体与荧光染料的限制你的灵活性设计实验相比,间接免疫荧光法。

这种灵活性是一个重大的优势间接免疫荧光法(如果有)。通常,不同的目标结构相同的标本需要可视化在免疫荧光反应,因此必须选择一个离散的荧光染料为每个目标分子。间接免疫荧光法,不同fluorescence-coupled二级抗体可以结合不同的初级抗体(考虑到物种的反应,当然)。相反,如果你想“玩”你的目标结构直接免疫荧光的颜色组合,你需要一个人每个颜色主要抗体。间接法的另一个优点是信号放大的二级抗体。多个二级抗体分子可以绑定到一个主要抗体,导致增加了荧光,这意味着更少的主要抗体已经被应用。

工作流的间接免疫荧光法(如果)可能需要更多的时间,但是由于可能的组合的初级和二级抗体和更经济的过程中大多数研究者的首选方法。

最重要的工具,高质量的免疫荧光染色(如果)是一个很好的主要抗体。与此同时,一个甚至多个商业上可买到的抗体可用于大约每个蛋白质几乎在每一个细胞类型。然而,有一些非常重要的注意事项。

精确的科学或临床声明基于你的免疫荧光染色,你必须确保你的主要的特异性抗体靶抗原。这样做你不应该只依靠商业提供者的语句。选择你的抗体根据已经使用和验证有关这一课题的文献主要抗体。检查抗体的数据表在制造商的网站上可用免疫荧光染色法染色和比较它们的照片与你的期望或其他插图出版。注意的单克隆抗体,单克隆抗体专门只绑定到一个表位,而多克隆抗体识别抗原表位,使非特异性标记非靶标结构的可能性更大。因此,单克隆抗体与特异性高、亲和力好通常更昂贵,但他们也取得更好的结果。

如果你想执行多色间接免疫荧光染色法,不同的初级抗体必须来自不同物种为了区分免疫复合物通过标签fluorescence-coupled二级抗体之后(见表1)。说,例如,您正在执行与抗体免疫荧光染色anti-protein源自鼠标,抗体anti-protein B从鼠兔和抗体anti-protein C。选择二级抗体时你必须记住,他们每个人都明确认识到只有一个主抗体。此外,荧光染料在这个例子的三个二级抗体必须区分不同波长光谱显微分析的荧光信号。如今,二次抗体与荧光染料与波长范围从紫外到红外对抗主要从几乎任何物种都可买到的抗体。因此研究者配置有限的可用显微镜(过滤集,激发激光)。

选项卡。1:这个例子多色间接免疫荧光法演示了如何标签simultanously三个不同的蛋白质位于相同的单元中。一分之三抗体必须来自不同物种为了用三种不同的fluorochrome-coupled二级抗体检测。二次抗体的荧光染料必须wavelenght不同频谱不同分析的显微镜。中出现的细胞样本图像也接受赫斯特33342年核染色。徕卡显微镜进行TCSSP2。

免疫荧光协议存在各种不同的标本或样品。最简单、最常用的方法是培养的染色真核细胞的细胞培养。附着生长细胞可以在盖玻片上播种,multiwell-inserts或直接在玻璃底部文化菜肴和用于免疫荧光(如果)所需的时间。免疫荧光(如果)也可能与悬浮细胞后细胞的应用对象,例如cytospin。在这两种情况下,重点是分析细胞内过程或结构,这是指定的免疫细胞化学(ICC)。

在免疫组织化学(包含IHC),另一方面,蛋白质的存在或分子在组织检查上下文。这里,超薄的部分器官的准备工作(通常是嵌入在石蜡)用于如研究蛋白质的表达在一个健康的器官而患病的人。除了准备组织部分也可以执行如果与整个生物体,这一过程被称为“山包含IHC”。为此,胚胎等不同的模式生物的鼠标,鸡肉或斑马鱼,例如,或植物生物模型拟南芥芥使用。在整个山包含IHC样本的大小是有限的和相关的免疫荧光(如果)试剂的穿透深度。单独的孵化的步骤需要更长的时间比培养细胞的染色。同时,显微镜具有特殊光学设备大型标本的分析必须是可用的。

特别要注意清洗步骤在一个免疫荧光过程中,因为免疫荧光(如果)可以增加适当的洗涤质量。PBS是标准洗涤缓冲,而变异,如PBS^{+ +}或PBS-T也普遍。美国公共电视台^{+ +}包含1毫米CaCl₂和MgCl_2,这是假定membrane-stabilizing效应阻止细胞的分离。PBS-T最终浓度0.05%的洗涤剂添加渐变20,目的是增加结合的特异性抗体。是非常重要的应用和吸入仔细清洗缓冲,以免分离的细胞培养瓶或盖玻片。如果你有足够的时间,允许几分钟愿望之间的清洗步骤,以确保有效的扩散洗涤缓冲到标本。一个免疫荧光过程的个人洗涤步骤中列出的标准协议如下。

传统的免疫荧光反应的各个步骤如下所述。最常见的程序的标准协议与文化细胞间接免疫荧光法是本文的结尾。

固定一个免疫荧光过程的第一步。我们的目标是维持细胞,细胞结构或组织的当前状态和保护化学试剂的制备在一段时间。在固定,这是很重要的细胞结构尽量留在本国构象。不同的固定方法可用于免疫荧光,每个试剂都有不同的影响主要抗体的抗原表位。抗体结合位点也可以掩盖或被固定,会损害免疫荧光染色的质量。因为每个抗体结合不同的抗原依赖的各种固定化合物,有必要尝试几种固定方法的新抗体。通常,规格可以找到一个合适的固定剂的抗体的数据表。理想的固定保存细胞和亚细胞结构和提供畅通无阻的抗原抗体结合。在现实中,你必须在两者之间取得平衡。

固定试剂可以大致分为两类:化学交联剂和有机溶剂。

化学交联剂如甲醛交联蛋白通过自由氨基酸组;在大多数情况下细胞形态保存完好。然而,抗原也交联,这可能减少抗体绑定。戊二醛对细胞结构也有防腐剂作用,但导致高的自发荧光显微镜(见样品控制)。

有机溶剂如甲醇或丙酮有使脱氢作用和沉淀蛋白,从而修复他们的细胞环境。但请记住,可溶性分子和许多脂类组件过程中丢失。经常使用甲醇和丙酮,因为尽管甲醇对细胞结构的保存是最好的,它有一个极其负面的影响在许多抗原表位。丙酮是危害较小。你也应该考虑到荧光蛋白等绿色荧光蛋白已经出现在你的细胞,将在很大程度上被固定的有机溶剂。如果制造商的主要抗体没有提出一个固定剂,4%甲醛在室温下10分钟开始适用于各种细胞系和抗原。

选项卡。2:固定试剂。

透化作用,细胞内结构成为抗体的访问,否则无法通过细胞的脂质膜。一个单独的透化作用的步骤是必要的,这取决于类型的固定。与有机溶剂修复时,细胞膜成为已经渗透和可以直接进行屏蔽。细胞固定与化学交联剂需要额外处理透化作用的清洁剂。古典洗涤剂像特里同x - 100或NP-40被应用,但皂素,渐变20或洋地黄皂苷也可以使用。再一次,得到了不同的结果,这取决于应用的物质,它的浓度和培养时间,所以你应该试试不同的参数。典型的开始代表一个透化作用与PBS Triton x - 100 0.1%在室温下15 - 20分钟。

如果你想分析lipid-associated或膜蛋白,如果你应该进行仔细透化作用的步骤(=脂质removement)。为此一个不错的选择是皂素,从质膜选择性地去除胆固醇,使细胞内的膜基本完好无损。如果省略透化作用在抗体染色(只可能通过与化学交联剂固定),你可以专门标记细胞外等离子体膜结合抗原,以区别于胞内抗原池。核酸染料如DAPI或赫斯特(见细胞核染色和示例安装)是membrane-permeable而不需要透化作用。

阻塞是重要的一步最小化不具体的绑定的主要抗体在细胞内。为了达到这个目标,蛋白质与牛血清白蛋白(BSA),可以使用奶粉或血清。是很重要的,这些阻碍蛋白质不是出自物种的主要抗体长大,否则二级抗体的特异性主要抗体将丢失。如果你使用二次抗体,如生产山羊对小鼠第一抗体,理想的屏蔽试剂是正常山羊血清。屏蔽解决方案通常利用在浓度1%(奶粉、BSA) 5%(正常血清)和稀释清洗缓冲。在室温下孵化发生30 - 60分钟。

样品制备后固定,透化作用和阻塞,实际发生免疫反应。具体的样品现在孵化主要抗体标记所需的目标结构。几个主要的抗体可用于标本在同一时间。正如上面提到的,几个主要抗体必须来自不同的物种在间接多色如果。执行抗体稀释在你选择屏蔽解决方案,最初根据制造商。如果你不满意你的染色,或如果制造商不提供任何信息在稀释工作,你应该试试浓度之间1:1,000 1:50。根据抗体的亲和力孵化时间可能会有所不同。默认的孵化时间1 - 2小时在室温下;隔夜孵化在4°C也是可能的。

如果你执行直接免疫荧光可以直接继续示例安装,作为主要的抗体已经带来了自己的荧光染料。现在二级抗体间接免疫荧光的荧光标记的主要抗体。一个至关重要的一点是大量洗涤后孵化与主抗体减少二次抗体的非特定的绑定。二次抗体也可以稀释在屏蔽解决方案或清洗缓冲区。如果不是表示不同的制造商可以先稀释1:200和孵化1 h在室温下。有必要进行孵化的步骤在黑暗中防止荧光染料漂白。

免疫反应往往是紧随其后的是细胞核染色DNA染料。一方面,这使得更好地定位在细胞或组织部分另它表明细胞在显微镜和状态(如有丝分裂),如果这是研究者感兴趣的。染料如赫斯特或DAPI,进入细胞核,即使没有透化作用和插入到DNA,用于。出于这个原因,你应该非常小心避免皮肤直接接触这些染料!188金宝搏的网址一个简单的核染色在室温下发生10分钟与赫斯特或DAPI在PBS稀释。

如果过程完成后,样品必须安装适合显微镜。为此安装介质(例如Mowiol或延长黄金)修复样本在显微镜幻灯片,也防止脱水。此外,越来越多的媒体提高折射率,这是有利与油浸显微镜的目标。一些制造商提供越来越多的媒体与DABCO等添加剂,防代理保护光漂白的样本。根据使用的荧光染料,一些防代理比其他人更有效。此外,越来越多的媒体与DNA染料也可以,所以,细胞核染色在嵌入和一个单独的核染色是多余的。如果使用硬化安装介质,通常情况下,样本在一夜之间可以治愈,所以显微镜检查是可能的第二天。永久准备生产这样几乎可以无限地储存在黑暗中在室温或4°C,但请记住,荧光染料的荧光强度随时间减少。

对于免疫荧光适当控制显微镜图像的正确解释。缺失或不正确的控制通常导致假阳性语句和不正确的数据。首先,你应该分析样本,只有被固定,permeabilized和阻塞以了解细胞自体荧光的隔间。有时结构出现高荧光,尽管如果没有染色。

作为调整的进一步控制和间接免疫荧光显微镜参数(如果有),使用一个样本,也被视为上面所描述的那样,但另外一直潜伏在二级抗体(ies)。首先,这将显示一个强烈的二次抗体非特异性结合标本。第二,显微镜参数,图像采集的过程中没有信号记录的控制。这个设置是用作后续收购一个阈值排除假阳性信号的二次抗体。直接免疫荧光(如果)自体荧光调整阈值控制服务。接下来,您分析的样本孵化的具体主要抗体和间接免疫荧光法(如果)也与二次抗体。这里一个荧光信号现在应该检测到上面的自发荧光和消极控制二级抗体。

为了确保第一抗体只标签所需的结构,一些制造商提供第一抗体阻断肽,掩盖了特定的抗原,从而防止抗体绑定到其抗原决定基。这是更贵但也最好的办法确定抗体的特异性,因此得到可靠的结果。在多色免疫荧光实验中还必须注意选择荧光染料之间的串扰。如果首次执行多色免疫荧光,此外污点是明智的目标结构在不同的准备和比较这些图像与多色图像。最后,你应该看一个精明的收购数据和比较它与你的期望和现有的数据在同一主要抗体。

选项卡。3:控制测试什么?

如前所述,如果有很多优势,但它也带来一些缺点。关键是样品的固定:修复意味着杀死,所以活细胞成像不再是可能的。因此动态过程的分析是复杂的,因为对于每个时间点细胞必须固定和染色。因此,如果快速动态过程是不明显的。这显然是一个优势的融合蛋白的表达与荧光标记等绿色荧光蛋白,适用于活细胞成像。如上所述,如果过程(修复/透化作用)改变了细胞结构,所以工件可能被解释为假阳性信号。所以有必要准备适当的控制每个如果染色,这可以耗时。另一个缺点是不可避免的:荧光染料光褪色。荧光蛋白就像绿色荧光蛋白也受此影响,但是当存储在适当的条件下,绿色荧光蛋白是检测甚至几个月后在永恒的准备工作。相反,如果荧光染料失去强度更快,这是反映在快速漂白的样本在显微镜。甚至越来越多的媒体与奢华的代理可以在这里只是暂时的帮助。

如果过程持续时间:约。5个小时。

这是一个标准协议间接免疫荧光法培养细胞在盖玻片固定的化学交联剂。

• 调湿室如果过程是完美的,可以很容易地白手起家的(见幻灯片“如何准备一个湿室”)。它可以防止干燥的准备和允许在黑暗中孵化,这是很重要的在处理现有的荧光蛋白荧光染料和必要的。
• 盖玻片的卷选择的方式是完全浸湿。确保样品没有完全干燥的运行。
• 孵化所有步骤在室温下进行。

幻灯片:如何准备一个湿润。

洗缓冲区

• 1×PBS(磷酸缓冲盐)

• 137毫米:氯化钠
• 2.7毫米:氯化钾
• 10毫米:Na₂HPO₄
• 1.8毫米:KH₂阿宝₄

• 调整pH值与HCl 7.2 - -7.4

• 在PBS^{+ +}添加最后一个1毫米CaCl的浓度₂和MgCl₂

• 对于PBS-T添加0.05%的最终浓度渐变20
  
  

固定的缓冲区

• 甲醛:

• 溶解4% PFA(多聚甲醛)在温暖的dH (50 - 70°C)₂在pH值8 O与氢氧化钠(调整)。
• 加10×PBS的最终浓度1×PBS(例如100毫升10×900毫升4% PFA / dH PBS₂O)。
• 调整pH值与HCl 7.2 - -7.4。

• 甲醇(prechilled到-20°C):

• 100%甲醇(-20°C)

• 甲醇/丙酮(prechilled -20°C):

• 50%甲醇丙酮(-20°C)和50% (-20°C)
  
  

透化作用缓冲

• tx - 100 (Triton x - 100):

• PBS的最终浓度为0.1% tx - 100

• 皂苷:

• PBS皂素的最终浓度为0.1%

• 其他洗涤剂可能被应用在同一浓度在PBS。
  
  

阻断缓冲区

• BSA(牛血清白蛋白):

• PBS BSA的最终浓度为1%

• 奶粉:

• PBS的最终浓度为1%的奶粉

• 正常血清:

• PBS的最终浓度为5%正常血清
  
  

核酸染料

• 赫斯特或DAPI:

• 准备一个解决方案的赫斯特33342年或DAPI决赛PBS工作1µg /毫升的浓度。