tirf显微镜
它允许对靠近玻璃/水（或玻璃/样品）界面的荧光分子进行成像。这是通过使用倏逝波激发荧光团来实现的，而不是通过弧光灯、LED或激光器提供的光直接照明。当入射光在两种不同折射率的透明介质界面上完全反射时，会产生倏逝场。在生物应用中，入射光通常是激光，其界面是盖玻片的玻璃和盖玻片与粘附细胞之间的一层水溶液。
随着渐逝场的能量随与界面的距离指数的指数降低，只有在覆盖物的一定邻近的荧光团被激发。这允许创建具有出色的信噪比的图像，因为细胞的其余部分中的荧光团几乎难以激发。此外，Tirf.显微镜提供的图像在100纳米以下具有极高的轴向分辨率。这允许观察膜相关过程，如细胞粘附、激素结合、分子运输以及胞外和胞内过程（如神经递质释放和摄取）。
全内反射和渐逝场
每当光遇到具有不同折射率的两个透明介质的界面时，它将部分衍射并部分地反映。在一定的发射角度下，所谓的临界角度，光线将完全反射，并且发生了称为全内反射的现象。如果光从具有较低折射率（例如水性介质，N = 1.33）的介质中，只能观察到从具有较高折射率（N）（例如玻璃盘子，N = 1.52）的介质中的培养基（例如，玻璃盘，N = 1.33）的介质，只能观察到总内反射。临界角度（θC)发生全内反射时，入射光的折射率可由斯奈尔定律确定：
N1和n2分别为试样和盖玻片的折射率。
发生全内反射时，入射光的一部分能量将转换为电磁场，并通过界面形成源自界面的倏逝波。出现的倏逝波与入射光具有相同的频率，其振幅随穿透深度呈指数衰减。因此，倏逝波中的荧光团不是由与光子的相互作用激发的，而是由与电磁场的相互作用激发的。该场的穿透深度通常在60到100纳米之间，但可以达到200纳米。它取决于光的入射角、波长和两种介质（例如盖玻片和试样的玻璃）的折射率。增加光的入射角导致穿透深度减小，而更高的入射光波长导致穿透深度增大。界面后介质（如试样）的折射率也会对穿透深度产生影响，因为较高的折射率会增加倏逝波的穿透深度。还应该指出，在Tirf.显微镜使用比共焦系统中通常使用的激光更强的高功率激光来形成具有足够能量的倏逝波。
TIRF显微镜的目的
在光学中实现全内反射有两种方法：一种是基于棱镜的，另一种是基于物镜的。以棱镜为基础Tirf.显微镜检查，棱镜附着在盖玻片的表面上，该表面将聚焦光束或激光指向盖玻片/介质界面。借助棱镜的帮助，穿透光的角度调节到临界角度。
现代的Tirf.显微镜系统通常是基于目标的。光，通常是激光，通过物镜引导到样本，该物镜也收集发出的荧光。强制性的目标是Tirf.显微镜功能具有极高的数值孔径（NA）（> 1.45A），其允许大于临界角度的入射角。目标的NA越高，渐逝场的可能穿透深度越低，因为光的入射角可以更平坦。与棱镜型方法相比，物镜透镜方法更方便，因为样品可偏好得很好，并且可以容易地改变激光的发生率。通过将激光光斑放置在物镜的后焦平面的不同区域中，用户可以选择激光的入射角，从而改变渐逝波的穿透深度。在棱镜的基础上Tirf.显微镜系统棱镜强烈限制了对样本的进入，使其难以如图所示。改变培养基，添加药物或进行生理测量。
而且，激光和使用不同入射角的对准在基于棱镜的系统中更复杂。此外，激光安全问题在棱镜的基础上产生Tirf.系统被基于目标的系统所克服。当棱镜系统中的激光或多或少地被引导进入棱镜时，物镜系统中的激光直接耦合到显微镜本身，并以非常明确的方式离开物镜。
生物装置中的全内反射
如上所述，Tirf.显微镜目标具有高数值孔径（> 1.45A），只能通过使用浸泡油或其他专用液体浸渍介质来实现。在典型的生物学设置中，用于产生渐逝波的激光必须通过物镜，浸渍介质和盖玻片，以在盖玻片/水（例如林克水溶液，PBS或其他成像缓冲液）界面处反射。为了避免反射和偏转效果，浸渍介质的折射率必须尽可能接近盖玻片（通常是n = 1.52）。对于标准浸入油，折射率为n = 1.515-1.518，在20℃下。当然，浸渍介质的折射率是温度依赖性的。尽可能多的实验，特别是在活细胞成像中，在37℃下进行，可能发生浸渍介质的折射率的温度诱导的变化。纠正这些变化，很多Tirf.显微镜目标配有校正项圈。
在生物装置中，全反射发生的界面通常是n = 1.52的玻璃盖层和盖层与细胞(n = 1.33)之间的水介质小膜之间的界面。然后消逝场通过这个水膜，直径约为7.5 nm的质膜，并进入细胞的胞质，在一定的穿透深度下它下降到零，穿透深度取决于激光的入射角。在一些地方，细胞直接粘附在盖玻片上，盖玻片和细胞之间没有水溶液(例如在细胞的局部粘附处)。在这种情况下，覆盖层和单元之间的界面就是全部内部反射的地方。由于电池的折射率(大约n = 1.38)不同于水溶液，当系统设置在盖层/水溶液界面时，这些斑点可能不可见。根据斯涅尔定律，全反射发生的临界角取决于介质的折射率，因此覆盖层/水溶液界面和覆盖层/电池界面的临界角是不一样的。这个问题可以通过改变激光的入射角来解决。
由于倏逝场的性质是指数衰减，因此仅激发盖玻片/水溶液（或电池本身）界面约60–100 nm范围内的荧光团（取决于设置）。这提供了通常为60–100 nm的轴向分辨率（在z平面上），使得能够观察位于质膜内或靠近质膜的荧光团，而不会被位于细胞其余部分的荧光团的荧光所淹没。事实上，只有细胞“切片”中的荧光团被倏逝场激发，这导致产生具有非常好的信噪比的图像，几乎没有来自离焦平面的背景荧光。
